Il corso si propone di introdurre i fondamenti teorici e le principali applicazioni biomediche della microscopia ottica, e di esporre i più recenti sviluppi nel settore. 

Nello specifico, il corso si articola in 4 tematiche e 2 laboratori finali:

I. Ottica del microscopio.

Concetti generali di ottica geometrica e radiometria (ingrandimento, apertura numerica, piani coniugati, invariante ottico). Il microscopio in ottica fisica: diffrazione della luce, propagatore del vuoto, propagatore della lente, ottica di Fourier, PSF e risoluzione. Il problema della risoluzione assiale. Sezionamento ottico. Microscopia confocale, microscopia a foglio di luce, microscopia ad onda evanescente (TIRFM). Aberrazioni in microscopia e loro correzione.

II. Spettroscopia molecolare e metodi di contrasto in microscopia.

Assorbimento, scattering. Microscopia a contrasto di fase, DIC, olografia digitale. Optical coherence tomography. Spettroscopia in fluorescenza (schema dei livelli, equazioni di rate, saturazione, fotobleaching). Microscopia a lifetime della fluorescenza (FLIM), trasferimento energetico risonante (FRET). Tipologie di fluorofori e tecniche di marcatura in vivo e ex vivo. Sensori funzionali (VSD, GCAMP, etc.). Proprietà ottiche dei tessuti biologici, cenni alle tecniche di schiarimento. Microscopia non lineare: eccitazione a due o tre fotoni, generazione di armoniche superiori. Microscopia vibrazionale: Raman spontaneo, Raman stimolato, CARS.

III. Acquisizione ed analisi dell’immagine.

Detector usati in microscopia: puntuali (PMT, APD) e array (CCD, CMOS). Caratteristiche generali (linearità, dark noise, electron well, etc.) e specifiche di ogni tipologia. Rumore di rivelazione. Principi di analisi dell’immagine: formati, filtri, deconvoluzione, segmentazione, quantificazione, strumenti principali (FIJI). Cenni alle tecniche di machine learning.

IV. Applicazioni e sviluppi avanzati.

Microscopia con sensibilità di singola molecola. Microscopie ottiche a super-risoluzione: luce strutturata, PALM/STORM, STED/RESOLFT. Microscopia in vivo. Tecniche di imaging 3D ad alta velocità. Optogenetica.

Laboratori finali:

I. Allineamento e caratterizzazione di un microscopio a campo largo. Caratterizzazione di un microscopio confocale. 

II. Analisi immagine con FIJI e Python.